| CRISPR/Cas9文库：最全CRISPR文库总结 | 您所在的位置：网站首页 › from page to screen文章 › CRISPR/Cas9文库：最全CRISPR文库总结 |
CRISPR/Cas9文库：最全CRISPR文库总结
|
2013年，Broad研究所的两个研究团队分别在Science杂志同一期上发表了CRISPR文库的相关研究。这是首次关于CRISPR文库的研究，显示了比shRNA文库更有效的筛选结果。（这两篇文章的通讯作者分别是张锋和Eric S. Lander，在该期杂志中，Eric S. Lander教授的文章在前，张锋的文章在后，但张锋的被引用量更高。） Eric S. Lander在Science杂志发表的文章：Genetic Screens in Human Cells Using the CRISPR-Cas9 System（利用CRISPR-Cas9在人类细胞种进行基因筛选）（图1）
图1 张锋在Science杂志发表的文章：Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells（在人类细胞中的基因组规模的CRISPR-Cas9敲除和筛选）（图2）
图2 在此之后，基于CRISPR/Cas9的工具得到了快速发展，这其中包括CRISPRa和CRISPRi，CRISPR敲除文库已经广泛用于证明新的生物学机制，如耐药性和细胞存活信号。在筛选功能增益方面CRISPRa非常有效；在筛选缺失功能方面CRISPRi 文库比RNAi文库更有效。 注： CRISPRa：CRISPR-dCas9-VP64 ，激活或增加基因的表达；目前已有通过VPR，SAM(MS2/p65/HSF1)，SunTag和p300等额外修改来增强CRISPRa的激活作用。 CRISPRi：CRISPR-dCas9-KRAB，干扰或沉默基因转录。 CRISPR/ Cas9系统之前介绍的比较多，此处不再赘述，详情可点击查看：CRISPR/Cas9：基因编辑的历史与发展。 人类基因的CRISPR文库 目前一共有13个人类基因的CRISPR敲除文库（图3）
图3-人类基因的13个CRISPR文库 目前有3个人类基因的CRISPRa文库和2个CRISPRi文库（图4）
图4-人类基因的CRISPRa文库和CRISPRi文库 小鼠基因的CRISPR文库 目前有7个小鼠基因的CRISPR敲除文库以及2个CRISPRa文库和1个CRISPRi文库（图5），小鼠CRISPR文库在体内模型上有很大优势，可以用于致癌作用和肿瘤转移研究。
图5-小鼠基因的CRISPR文库 CRISPR文库的使用 主要有两种方法使用文库俩进行靶基因筛选，一种是阳性选择，通过随机诱变收集具有生长优势的群体。（图6）
图6-Positive selection 另一种是阴性选择，可以确定特定条件下生存的必须基因，如果一个细胞携带了靶向生存必须基因的gRNA，那么敲除后的细胞不能存活。（图7）
图7-Nagative selection CRISPR文库的质粒系统 有两种CRSIPR/Cas9文库系统，一种是单质粒系统，包括了启动子、gRNA、Cas9以及筛选标记（图8），单质粒系统的优点是一次转染同时转入gRNA和Cas9，但是单质粒质粒系统过于庞大导致感染效率较低。
图8-All in One的单质粒系统 另一种是双质粒系统，双质粒系统优点是效率更高，因为质粒只包含gRNA和最佳启动子，一旦表达Cas9的细胞建立起来就可以了，但是双质粒系统需要转染两次。双质粒系统修改起来也更方便，比如可以使用四环素诱导的Cas9，用于构建特定条件性敲除细胞。
图9-双质粒系统 CRISPR文库的应用 使用CRISPR文库进行阳性选择可以检测特定条件下生存的细胞，如药物治疗，而且可以很容易地阐明耐药机制。 使用CRISPR文库进行阴性选择可以有效地检测死亡或者缓慢生长的细胞，而且可以识别生存必须基因，这可能成为分子靶向药物的有效候选者。另外，阴性选择可以应用于合成致死性相互作用，其中两个基因的同时变化会导致生存力丧失，但是任一基因变化不影响生存力。这一机制对于确定分子靶向药的最佳组合具有重要意义。利用新的方法，如成对的引导RNA系统和与单细胞RNA测序技术相结合，可以识别癌细胞中生存的共同必需基因。 参考文献 1.Kurata Morito,et al. CRISPR/Cas9 library screening for drug target discovery.[J] .J. Hum. Genet., 2017. 2.Wang Tim,et al. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system.[J] .Science, 2014, 343(6166): 80-4. 3.Shalem Ophir,et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.[J] .Science, 2014, 343(6166): 84-87. 相关阅读 1.CRISPR/Cas9：基因编辑的历史与发展 2.LncRNA与癌症：最全LncRNA明星分子总结 3.circRNA与癌症：最全癌症相关circRNA明星分子总结 4.科研神器GeenMedical 2.0版发布，有了这个它，忘了sci-hub |
【本文地址】